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对我国遗传性牙龈纤维瘤病SOS1基因的研究

The investigation into SOS1 gene of hereditary gingival fibromatosis from Chinese parentage

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内 容 提 要

遗传性牙龈纤维瘤病（hereditary gingival fibromatosis, HGF）是一种罕见的牙龈组织弥漫性，渐进性增生为特征的良性病变。多有家族史也可散发，多为常染色体显性遗传，也有隐性遗传的报道。由于病因不明，治疗多以外科手术切除为主，但术后易复发。给患者带来了极大的痛苦。近年来随着人类基因组计划的不断发展，关于HGF的致病基因的研究已有所进展。但由于HGF遗传基因存在着明显的遗传异质性，对其致病基因的定位有待进一步的研究。本实验我们采用Southern 印迹杂交的方法对我国现有的两个家族遗传性牙龈纤维瘤病家系进行国外已证实的已知基因突变位点——SOS1（son of sevenless 1,SOS1）基因21号外显子的排除性定位。其结果表明：(1)SOS1基因的21号外显子都存在并没有缺失，并且其中没有较大片段的插入或缺失。(2) 发现有典型临床症状者13人中有5例存在着Hart等已证实的SOS1基因突变(第126，142和126，143位核苷酸间有一胞嘧啶插入)，而其余8人未发现这一突变。剩余9个无典型临床症状和11个正常对照样品中则不存在这一突变。因此可得出结论：我国两家系HGF中虽然存在国外已证实的SOS1基因21号外显子的突变，但其并不是我国血统的主要致病基因。我国血统HGF的主要致病基因仍需要进一步研究。

关键词:遗传性牙龈纤维瘤病  SOS1基因  Southern 印迹杂交  点突变
 
目    录

引　言…………………………………………………………1
材料和方法…………………………………………………5
结　果……………………………………………………17
讨　论……………………………………………………21
结　论…………………………………………………26
参考文献………………………………………………27
中文摘要……………………………………………………1
英文摘要…………………………………………………5
致　谢……………………………………………………
 
引      言

遗传性牙龈纤维瘤病（hereditary gingival fibromatosis，HGF）也叫特发性牙龈纤维瘤病（idiopathic gingival fibromatosis）、家族性牙龈纤维瘤病（familial gingival fibromatosis），或牙龈橡皮病（elephantiasis gingivae）[1],是一种以牙龈组织的弥漫性，渐进性纤维结缔组织增生为主要特点的良性病变。患者多有家族史，也可散发。遗传方式主要是常染色体显性遗传，少数有常染色体隐性遗传的报道[2]。其临床表型复杂，具有高度遗传异质性 [1,3,4] ，可以是以牙龈增生为唯一表现的非综合征型HGF，主要表现为全口牙龈广泛纤维性增生，颜色正常，表面光滑或呈结节状，质地坚韧，增生的牙龈覆盖部分牙冠或全冠，严重者影响咀嚼，语言及口唇闭合；也可以与一些罕见的综合征合并出现[5,6 ]。HGF发现至今其病因及发病机制一直是医学界悬而未决的难题，由于病因不明，治疗方法多局限于手术切除，且术后极易复发。近年来随着基因组计划的不断推进和分子遗传学的飞速发展。多数研究者将注意力集中于HGF致病基因的研究，而且已经取得了一系列进展。
目前研究认为与HGF发病有关的基因位点有四个。（1）Hart [7]在对显性遗传不伴有任何并发症的HGF巴西家族进行全基因组扫描和连锁分析将致病基因定位在染色体2P21，去年已将候选基因范围进一步缩小为2.3Mb,并对16个候选基因全部测序发现了SOS1基因突变。（2）Fryns [8]在对一位伴有智力迟钝的牙龈增生的小男孩的研究中发现在染色体2P13—>P21上有复制。（3）我国肖尚喜[9]等人在研究中发现一个无并发症的HGF家族的致病基因与2P21上的基因标志不连锁，通过全基因组扫描将致病基因定位于染色体5q23-q22，定位范围为39cm，约为30Mb，基因重组抑制在遗传标志D5S1491和D5S1453之间，在这一区域内编码钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶的基因是重要的候选基因之一。在同种血缘者中，凡口腔牙龈增生者，在染色体5q23-q22位点上均有突变，无临床症状者则无突变。(4)Zhang [10]等在研究HGF致病基因的过程中，于2001年克隆并鉴定了一新的基因C2orf8(chromosome 2 open reading frame 8)，他们通过荧光原位杂交技术将此基因定位于2P22->P21，然后再进一步定位于D2S2238和D2S2331之间的 BAC RP11 288L6。该基因包括具有高度保守的S--腺甘甲硫氨酸依赖性甲基转移酶结构域，分析证实在C2orf8基因上有10个外显子。在胎盘的RACE分析结果发现在5′不翻译区有该基因多种不同质的转录物，通过RT-PCR和Northern印记分析可以检测到C2orf8选择性转录和组织的特异性表达。C2orf8和假定的蛋白产物生物信息学研究证实了三种存在于许多真核和原核物种中的甲基转移酶。但最后C2orf8的测序分析排除了编码区的突变导致了HGF。虽然如此，因HGF遗传基因存在着明显的遗传异质性，对于不同血统，不同临床表现的家族是否会有此基因的突变还需进一步研究以待证实。
2002年，Hart[11]等证实SOS1基因（son of sevenless 1,SOS1）位于21号外显子区的第126，142和126，143位核苷酸间有一胞嘧啶插入，导致编码蛋白质的阅读框架移位，产生一个提前的终止密码子，使SOS1蛋白羧基末端四个重要的富脯氨酸SH3黏附功能缺失，形成正常氨基末端与异常羧基末端融合成的蛋白嵌合体，是导致巴西HGF一个家系的直接根源，这种SOS1基因突变在转基因小鼠中出现皮肤肥厚，该基因是目前唯一被成功克隆与鉴定的HGF相关基因。因而激发我们思考，对于我国血统SOS1基因21号外显子的突变是否是一“突变热点” ，故对现有的我国的两个家系HGF的致病基因研究分析。我们用国外已证实的SOS1基因突变的的基因作为模板DNA，合成具有放射性的寡核苷酸探针来检测是否存在这一突变。用正常序列的基因作为模板DNA，合成具有放射性的寡核苷酸探针来检测基因是否正常。其结果显示：有典型临床症状者13人中有5例存在着已证实的SOS1基因突变，而其余8人未发现这一突变。剩余9个无典型临床症状和11个正常对照样品中则不存在这一突变。因此我国两家系HGF中虽然存在国外已证实的SOS1基因21号外显子的突变，但其并不是我国血统的主要致病基因。
 
材料和方法

一. 材料和仪器
(一)材料
1.  试剂
1.1 EDTA,STMT溶液，NE溶液，10%SDS， 氯仿，异戊醇，TE缓冲液，琼脂糖，双蒸水，甲酰胺，丙烯酰胺，10%过硫酸胺，TEMED，TAE缓冲液，TBE缓冲液，10%乙醇，7%硝酸银溶液，醋酸钠，甲醛溶液，3%乙酸溶液，以上试剂均由吉林大学基础医学院分子生物学教研室提供。
1.2 TE饱和酚，蛋白酶K ，TaqDNA聚合酶，dNTPMixture，PCR反应buffer，Mg2+ 溶液，pst1限制性内切酶，鲑鱼精DNA，牛血清白蛋白均购于宝泰克生物科技公司。
1.3 [α－32P] dATP和dCTP混合液购于北京市福瑞生物工程公司。
2.  标本
2.1 两个遗传性牙龈纤维瘤病家系
2.1.1临床表现：全口牙龈弥漫性增生肥厚，呈结节状，家系Ⅰ牙龈覆盖全部牙冠或牙冠的2/3，家系Ⅱ牙龈覆盖牙冠的1/3到2/3，质地坚硬，色泽与正常牙龈相同，无服药史，无明显的并发症，均为乳恒牙交替时开始出现牙龈的增生肥厚,未检查到有其他合并症。