毕 业 论 文 （设 计）
题 目：穿山龙黑斑病病原菌鉴定
及其生物学特性初步研究
院 （系）： xxx学院
专 业： xxxx
姓 名： xxx
目 录
中文摘要 1
英文摘要 2
前言 4
1材料与方法 5
1.1供试材料来源 5
1.2症状观察 5
1.3寄主上病原菌观察 5
1.4病原菌的分离与纯化 5
1.4.1病原菌分离 5
1.4.2病原菌纯化 5
1.5分离菌株的观察 6
1.5.1菌落特征观察 6
1.5.2分离菌株病原菌观察 6
1.5.3分离菌株病原菌着生状态观察 6
1.6人工接种试验 6
1.6.1接种材料 6
1.6.2接种方法 6
1.7鉴定 7
1.8病原菌的生物学特性研究 7
1.8.1分生孢子萌发与不同环境因子的关系 7
1.8.1.1分生孢子萌发与温度关系 7
1.8.1.2分生孢子萌发与湿度的关系 7
1.8.1.3分生孢子萌发与pH值关系 7
1.8.1.4分生孢子萌发与营养的关系 8
1.8.1.5分生孢子的致死温度测定 8
1.8.2菌落生长与不同环境因子的关系 8
1.8.2.1菌片的准备 8
1.8.2.2菌落生长与光照的关系 8
1.8.2.3菌落生长与温度的关系 9
1.8.2.4菌落生长与pH值的关系 9
1.8.2.5菌落生长与营养物质的关系 9
2结果分析 9
2.1穿山龙黑斑病病状描述 9
2.2寄主上病原菌形态特征 10
2.3培养性状 11
2.4分离菌株的形态特征 11
2.5人工接种试验 11
2.6病原菌生物学特性 12
2.6.1分生孢子萌发与温度的关系 12
2.6.2分生孢子萌发与湿度的关系 13
2.6.3分生孢子萌发与pH值的关系 14
2.6.4分生孢子萌发与营养物质的关系 15
2.6.5分生孢子的致死温度 16
2.6.7菌落生长与光照的关系 16
2.6.8菌落生长与温度的关系 17
2.6.9菌落生长与营养物质的关系 18
2.6.10菌落生长与pH值的关系 20
3结论 20
参考文献 22
致谢 24
摘 要
穿山龙(Dioscorea nipponica Makino)别名串龙骨、地龙骨、野山药、穿地龙、穿龙骨，即穿龙薯蓣，为薯蓣科植物穿龙薯蓣多年生缠绕草质藤本药用植物，产于辽宁、吉林、黑龙江、河北、内蒙古、山西、陕西等省、自治区。
穿山龙有效成份皂素是甾体激素类药物的重要合成原料。长期以来我国穿山龙的原料主要来源于野生。由于国内外合成甾体激素类药物迅速发展，穿山龙需求量也在迅速增长。据报道，2002年国际年需求皂素7000吨，我国年需3000吨，但年产只有1000吨，且主要来源盾叶薯蓣黄姜皂素。穿山龙皂素因溶解性好、远优于黄姜皂素，可供出口，市场缺口大、经济效益高。
近年来穿山龙发生一种叶部病害，初步观察认为该病是一种新发生的严重病害，由链格孢属真菌引起，定名为穿山龙黑斑病。本文对辽宁省清原满族自治县采集的穿山龙黑斑病病株叶部组织进行分离纯化，得到一种真菌，根据其形态特点、培养性状、寄主等特征鉴定为薯蓣链格孢（Alternaria dioscoreae Vasant Rao）,进行了人工接种试验，从而确定了薯蓣链格孢（Alternaria dioscoreae Vasant Rao）是该病的致病菌。并对薯蓣链格孢（Alternaria dioscoreae Vasant Rao）的生物学特性进行了初步研究，其中包括分生孢子萌发和菌落生长与温度、湿度、pH值、营养物质关系，以及分生孢子的致死温度测定。
结果表明，分生孢子在5℃-30℃之间均能萌发，最适温度是20℃-25℃；在RH为86%-100%时均能萌发，最适RH是100%；在pH为4-11之间均能萌发，萌发偏酸性，最适pH值为6；在1%蔗糖、1%葡萄糖、1%D-半乳糖、1%D(+)-木糖、1%D-甘露糖、1%L-(+)树胶醛糖、1%D-果糖、CK中均能萌发，证明了糖分有利于分生孢子的萌发，在1%蔗糖、1%D-果糖、1%D-甘露糖中孢子的萌发率较高；其致死温度为48℃；光照条件有利于该菌的生长；该菌在5℃-30℃中均能生长，最适温度是25℃-30℃；在查彼果糖培养基、查彼葡萄糖培养基、查彼蔗糖培养基、查彼甘露糖培养基、PDA与寄主汁液培养基、半乳糖琼胶培养基、蔗糖琼胶培养基、木糖琼胶培养基、水洋菜培养基、麦芽膏琼胶培养基、玉米叶琼胶培养基、甘露糖琼胶培养基、PDA均能生长，最适培养基为木糖琼胶培养基、PDA、查彼葡萄糖培养基、PDA+寄主汁液培养基、蔗糖琼胶培养基、半乳糖琼胶培养基、甘露糖培养基；在pH值为4-10之间均能生长，最适pH为6。
关键词：穿山龙；黑斑病；薯蓣链格孢
Abstract
Byname of Dioscorea nipponica Makion were Chuanshanlong, Dilonggu, Yeshanyao, Chuanlonggu. It belonged to herb medicine plant of yam faculty. It was planted in the province of Liaoning, Jilin,Heilongjiang, Shanxi, Shannxi, and so on.
Soap which was effective composition of Dioscorea nipponica Makino was the importance compound material of acesodyne medicine. For long time in our country the main source of the raw material was Dioscorea nipponica Makino in wild. Because of domestic and international synthesize hormone medicine and the demand of Dioscorea nipponica Makino quickly increased. According to the report, in the year of 2002, international soap needed 7000t,our country needed 3000t, but the production of year was 1000t,coming from yellow ginger soap of main source shield leaf vegetable. Because the deliquescence of Dioscorea nipponica Makino soap was far better than yellow ginger soap, which can provide export. The market indentation was big. The economic performance was high.
Dioscorea nipponica Makino had a serious disease , accidence observing the research that disease was a new occurrence of a kind of leaf department was take placed to harm, It was caused by Alternaria fungi, named black spot disease. This paper referred to separate and sublime black spot disease, collected in Qinyuan Manchu autonomy county of liaoning province. we separated the fungi and get the original fungi of black spot disease, according to characteristics of its appearance, proceeds artificial inoculating experimenting, we made sure the Alternaria dioscoreae Vasant Rao was nosogenesis. Later we had done some examination, such as temperature, degree of humidity, pH, biology characteristic and so on.
In conclusion, the optimum temperature of germination for spore was 20℃-25℃.Among RH6 and RH100,the spore can germinate, The optimum degree of humidity was 100%;the spore at pH 4-11 can germinate, the optimum pH was 6;In 1% canesugar, 1%glucose, 1%D- half lactose, 1%D(+)-wood sugar,1%D-sweet dew sugar,1% D-fructose, CK(water), the spore can germinate, the optimum nourishment was were 1%cane sugar, 1%D-fructose, 1%D-sweet dew. sugar. the temperature of cause death was 48℃; The light term benefit the growth of that fungi; The fungi at 5℃-30℃ can grow, the optimum temperature was 25℃-30℃ and so on.
Key words：Dioscorea nipponica ; Black spot disease ; Alternaria dioscoreae
前 言
穿山龙（Dioscorea nipponica Makino）别名串龙骨、地龙骨、野山药、穿地龙、穿龙骨，即穿龙薯蓣，为薯蓣科植物穿龙薯蓣多年生缠绕草质藤本药用植物。产于辽宁、吉林、黑龙江、河北、内蒙古、山西、陕西等省、自治区。常生于山腰的河谷两侧半阴半阳的山坡灌木丛中和稀疏杂木林内及林缘，而在山脊路旁及乱石覆盖的灌木丛中较少，喜肥沃、疏松、湿润、腐殖质较深厚的黄砾壤土和黑砾壤土,常分布在海拔100～1700米，集中在300～900米间。
多年生缠绕草本。根茎横走，圆柱形，黄褐色。茎左旋细长，近乎无毛。叶互生，叶片卵形或广卵圆形，带5～7浅裂，先端渐尖，基部心形。花黄绿色，小，雌雄异株，穗状花序，腋生，雄花序复穗状，雌花序单一，下垂，绿黄色。蒴果卵形或椭圆形，具3翅，成熟后黄褐色。种子上部具长方形膜质翅。
其有效成分皂素是甾体激素类药物的重要合成原料。长期以来我国穿山龙的原料主要来源于野生，由于国内外合成甾体激素类药物迅速发展，穿山龙需求量也在迅速增长。据报道，2002年国际年需求皂素7000吨，我国年需3000吨，但年产只有1000吨，且主要来源盾叶薯蓣黄姜皂素。穿山龙皂素因溶解性好、远优于黄姜皂素可供出口，市场缺口大、经济效益高。
为了明确穿山龙黑斑病病原菌种类及其形态学特性，以便服务于穿山龙的人工栽培，根据植保学院药用植物病害研究室的总体科研计划，结合本人毕业论文工作，进行了穿山龙黑斑病病原鉴定及其生物学特性的初步试验，现将初步试验结果报告如下。
1材料与方法
1.1供试材料来源
穿山龙黑斑病标样采自辽宁省清原满族自治县南口前和英额门药材园，病株为2-3年生，田间黑斑病发病率达60%-70%以上。
1.2症状观察
选取具有典型症状的穿山龙黑斑病病叶观察，描述其症状。
1.3寄主上病原菌观察
选取具有典型症状的穿山龙黑斑病病叶，进行镜检。
方法：直接用针挑取少许菌丝体，放在加有水滴的载玻片上，加盖玻片后在显微镜下镜检。
1.4病原菌的分离与纯化
1.4.1病原菌分离
采用组织分离法：取穿山龙黑斑病病叶，从病健交界处切取0.5cm×0.5cm的病组织，在链霉素水溶液中浸泡10min，再在0.1%升汞溶液中浸泡30s～3min，而后用灭菌水换洗3次，将其移置PDA平板上培养[1]。
1.4.2病原菌纯化
采用微块单孢分离法：挑取供纯化菌种的孢子少许加于试管内的无菌水中，摇动混合1-2min使孢子充分散开。调节孢子浓度到10倍视野中2-5个孢子。取此孢子悬浮液2-3ml倒入4%水洋菜平板表面，轻轻左右摇动培养皿使孢子液均匀展布于培养基表面静置5min，使大部分孢子沉淀，然后倾斜培养皿，用吸管吸去多余的孢子液。用灭菌刀将带有分散孢子的水洋菜平板切成0.3cm×0.3cm小块，移至载玻片上检查。逐个检查，见有单个孢子的微块，随即用移植铲移入PDA培养基中培养，每皿可放4-5块[1]。
1.5分离菌株的观察
1.5.1菌落特征观察
方法：直接用移植钩挑取纯化后菌株的菌丝，接种于PDA平板中央，于25℃恒温箱中培养7d，每天观察记录菌落形态。 |
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穿山龙黑斑病病原菌鉴定及其生物学特性初步研究
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