正常人与尿石患者尿液中纳米微晶的研究

目   录
目录 …………………………………………………………………………………ⅰ
摘要 …………………………………………………………………………………Ⅴ
Abstract  ……………………………………………………………………………ⅳ
第一章 前 言…………………………………………………………………………1
1.1 泌尿系结石的无机组分及其表征手段………………………………………1
1.1.1无机晶体组分……………………………………………………………1
1.1.2 表征手段…………………………………………………………………2
1.1.2.1 红外光谱……………………………………………………………2
1.1.2.2 拉曼光谱……………………………………………………………3
1.1.2.3 核磁共振光谱………………………………………………………4
1.1.2.4 高效液相色谱………………………………………………………4
1.1.3 尿石中主要晶体成分草酸钙的存在形成………………………………4
1.1.4 尿液微晶与尿结石的关系………………………………………………5
1.1.5 尿结石形成的动力学过程………………………………………………6
1.2 抑制剂对草酸钙结石形成的抑制机理………………………………………7
1.2.1 尿石形成的抑制剂………………………………………………………7
1.2.2 抑制机理…………………………………………………………………7
1.2.2.1 抑制剂及其盐与钙离子的螯合作用………………………………7
1.2.2.2 抑制草酸钙晶体成核和生长………………………………………8
1.2.2.3 抑制晶体聚集………………………………………………………9
1.3 中草药治疗尿结石的研究进展 ……………………………………………10
1.3.1 中草药的提取方法 ……………………………………………………10
1.3.1.1 煎煮法 ……………………………………………………………10
1.3.1.2 浸渍法 ……………………………………………………………10
1.3.1.3 渗漉法 ……………………………………………………………10
1.3.1.4 微波提取 …………………………………………………………11
1.3.1.5 超声波提取 ……………………………………………………¬¬¬¬¬¬¬¬¬…11
1.3.1.6 超临界提取 ………………………………………………………12
1.1.2 壳聚糖的作用 …………………………………………………………12
1.3.3 中草药治疗泌尿结石的研究方法 ……………………………………13
1.3.3.1 体外实验 …………………………………………………………13
1.3.3.2 动物实验 …………………………………………………………14
1.3.2.3 临床观察 …………………………………………………………15
1.4 选题依据 ……………………………………………………………………15
参考文献 …………………………………………………………………………16
第二章 尿液中的纳米微晶及其与尿石形成的关系…………………………… 24
2.1 试剂 …………………………………………………………………………24
2.2 仪器 …………………………………………………………………………24
2.3 尿样的处理 …………………………………………………………………24
2.4 结果和讨论 …………………………………………………………………24
2.4.1 正常人和患者尿液中微晶的形貌………………………………………24
2.4.2 正常人和患者尿液微晶的大小及分布…………………………………26
2.5 结论 …………………………………………………………………………28
参考文献 …………………………………………………………………………29
第三章 尿液微晶的成分分析………………………………………………………31
3.1 试剂 …………………………………………………………………………31
3.2 仪器 …………………………………………………………………………31
3.3 实验方法 ……………………………………………………………………31
3.3.1 临床资料…………………………………………………………………31
3.3.2 尿液处理方法……………………………………………………………31
3.4 结果 …………………………………………………………………………32
3.4.1 X射线衍射  ……………………………………………………………32
3.4.1.1正常人尿液中的微晶 ……………………………………………32
3.4.1.2 结石病人尿液中的微晶…………………………………………  33
3.4.2 傅立叶红外光谱………………………………………………………… 34
3.5 讨论 …………………………………………………………………………  37
参考文献 ………………………………………………………………………… 39
第四章 土家族药物天葵化石汤对草酸钙晶相和晶体生长的调控作用 ………  42
4.1试剂…………………………………………………………………………… 42
4.2仪器…………………………………………………………………………… 42
4.3方法…………………………………………………………………………… 42
4.3.1 壳聚糖凝絮剂的制备……………………………………………………43
4.3.2 天葵化石汤提取液的制备 ………………………………………………43
4.3.3 晶体培养 …………………………………………………………………43
4.4结果与讨论 ……………………………………………………………………44
4.4.1天葵化石汤对草酸钙晶相的影响 ………………………………………44
4.4.1.1天葵化石汤剂量对草酸钙晶相的影响  ……………………………44
4.4.1.2 体系pH对草酸钙晶相的影响 …………………………………… 47
4.4.2 天葵化石汤对草酸钙生长的影响………………………………………50
4.5 结论  …………………………………………………………………………51
参考文献 …………………………………………………………………………52
第五章 结论、问题与展望 ……………………………………………………… 54
5.1 结论 ………………………………………………………………………… 54
5.2 问题与展望 …………………………………………………………………55
参考文献………………………………………………………………………… 56
附录 …………………………………………………………………………………57

摘 要

采用透射电子显微镜（TEM）、纳米粒度仪、X射线衍射（XRD）和傅立叶红外光谱(FT-IR)比较研究了正常人与尿石患者尿液中纳米微晶的形貌、尺寸、分布及其化学组成。正常人尿液中纳米微晶的形貌较为圆钝，尺寸分布均匀，大都在100-300 nm之间；而患者尿液中的纳米微晶棱角较为尖锐，尺寸分布不均匀，从几十纳米到1000 nm不等。上述差异归因于正常人尿液中抑制剂的浓度及其活性比尿石患者的高，能抑制尿液中纳米微晶的生长和聚集。
正常人尿液微粒以结晶态物质为主，其中以磷酸铵镁为主要成分的占66.7%，尿酸为主的占16.7%，一水草酸钙(COM)和β-磷酸三钙混合物为主的占16.7%；在结石病人中，尿液微晶以COM为主要成分的占33.3%，以磷酸八钙为主的占33.3%，以COM和β-磷酸三钙的混合物为主的占16.7%，以β-磷酸三钙和非晶态物质的混合物为主的占16.7%。
采用扫描电子显微镜（SEM）、XRD和FT-IR研究了土家族药物天葵化石汤的提取液对尿石晶体草酸钙(CaOxa)晶相和晶体生长的影响。天葵化石汤提取液能够抑制COM晶体生长、诱导二水草酸钙（COD）形成。而且，能够抑制草酸钙晶体成核，使晶体形貌变得圆钝。

关键词：尿液微晶； 尿结石； 天葵化石汤； 草酸钙； 晶相

Abstract

Transmission electron microscopy (TEM), nanoparticle size analyzer and X-ray power diffraction (XRD) and Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) were used to investigate the morphology, size, its distribution and composition of nanocrystals in urine of lithogenic patients and healthy persons. Most of the nanocrystals in urine of healthy persons are round with a size range from 100 to 300 nm. However, nanocrystals in lithogenic urine are sharp with a size range from several tens to 1000 nm. These results were explained by higher concentration and activity of urinary inhibitors in healthy urine than that in lithogenic urine, the inhibitors in healthy urine can inhibit the growth and aggregation of nanocyrstals.
Most of the particles in urine of healthy persons were crystalline material, and the main composition of urinary crystallites in 66.7% healthy persons was magnesium ammonium phosphate, and that of 16.7% was uric acid, 16.7% was a mixture of calcium oxalate monohydrate (COM) and tricalcium phosphate. However, the main composition of urinary crystallites in 33.3% lithogenic patients were COM, 33.3% were octacalcium phosphate, 16.7% was a mixture of tricalcium phosphate and COM, and 16.7% was a mixture of tricalcium phosphate and amorphous materials.                                    
The effect of the extract from Tiankui soup on the phase compositions, nucleation and shape of calcium oxalate (CaOxa) were studied by Scanning electron microscopy (SEM), XRD and FT-IR. Tiankui soup can inhibit the growth of COM crystals and induce the formation of COD crystals. Moreover, Tiankui soup can inhibit the nucleation of calcium oxalate, and make the crystal shape more rounded.

[Key Words] Urinary crystallite; urinary stone; Tiankui Soup; calcium oxalate;  crystal phase

第一章  前  言

生物矿化是生物体内无机矿物的形成过程，包括两种形式：一种是正常矿化，如骨骼、牙齿；一种为异常矿化，如龋齿、泌尿系结石[1]。它区别于一般矿化的特征是，它通过有机大分子和无机物离子在界面处的相互作用，从分子水平控制无机矿物相的析出，从而使生物矿物具有特殊的多级结构和组装方式[2,3]。生物矿化中，由细胞分泌的自组装的有机物对无机物的形成起模板作用，从而使无机矿物具有一定的形状、尺寸、取向和结构。
泌尿系结石是生物体内异常生物矿化的产物，许多学者采用体外模拟方法研究了尿石形成过程、抑制机理等问题，但至今为止，尿液微晶与结石形成的关系还没有完全弄清楚，且中草药治疗结石的机制尚不清楚。因此，进一步弄清结石形成机理，开发新的治疗结石的药物对防治结石，减轻结石患者的痛苦具有重要的科学意义和现实意义。

1.1 泌尿系结石的无机组分及其表征手段
1.1.1 无机晶体组分
泌尿系结石由晶体和基质两类物质组成，其中晶体成分占绝大部分。用现代物理化学方法分析尿石晶体成分，如一水草酸钙(COM)、二水草酸钙(COD)、羟基磷灰石(HAP)、碳酸磷灰石、二水磷酸氢钙、三水磷酸氢钙、一水磷酸铵镁、六水磷酸铵镁、磷酸三钙和磷酸八钙，尿酸和胱氨酸等，其矿物名和化学式如表1.1所示[4-6]。

表1.1 尿结石的主要矿物成分和化学分子式[4-6]
化学名 矿物名 化学式
一水草酸钙 － CaC2O4•H2O
二水草酸钙 － CaC2O4•2H2O
磷酸三钙 白磷钙矿 Ca3(PO4)2
羟基磷灰石 羟磷灰石 Ca5(PO3)3(OH)
碳酸磷灰石 磷碳灰石 Ca10(PO4,CO3,OH)6(OH)2
磷酸八钙 － Ca8H2(PO4)6•5H2O
二水磷酸氢钙 透钙磷石 CaHPO4•2H2O
三水磷酸氢镁 镁磷石 MgHPO4•3H2O
六水磷酸铵镁 鸟粪石 MgNH4PO4•6H2O
一水磷酸铵镁 磷酸镁铵石 MgNH4PO4•H2O

尿pH是影响结石组分的重要因素。Murayama等[7,8]研究了结石病人的结石成分和尿pH的昼间变化。尿酸(UA)结石病人的尿pH一直很低；草酸钙(CaOxa)结石和CaOxa-磷酸钙(CaP)混合结石的门诊病人的尿pH在清晨较低，白天逐渐升高，在夜间又降低；而磷酸铵镁结石病人的尿pH在全天中都很高。住院病人的结石成分与昼间pH变化间具有相似的关系，但门诊病人的尿pH曲线比住院病人更偏酸性。尿酸和CaOxa结石在酸性尿液中形成，而CaP结石在碱性尿中形成。在CaOxa-CaP混合结石病人中，CaOxa晶体在pH较低的早晨形成，而CaP在pH较高的下午和晚上形成，当pH升高时，形成的CaP晶体更多。这些发现表明，尿pH可能在决定结石成分中起重要作用。

1.1.2 表征手段
仪器分析技术广泛地运用于泌尿系结石的组分分析。特别是近年来，许多现代仪器分析技术，如拉曼光谱、红外光谱、差热-热重(TGA/DTA)、核磁共振(NMR)、高效液相色谱(HPLC)、傅立叶变换红外光谱(FT-IR)和X-射线衍射(XRD)等均被应用于尿石的定性和定量分析。

1.1.2.1 红外光谱
利用傅立叶转换红外光谱特征峰可以鉴定不同组分的结石。例如，在鸟粪石的FT-IR光谱中，在1010 cm-1位置处有一强吸收谱带，在2370、760和572 cm-1处有较弱的特征吸收峰，根据这些特征峰很容易把鸟粪石从其它类型的尿石组分中区分出来[9]。利用FT-IR 可以用于草酸钙结石的定性分析和定量分析，COM的羰基不对称伸
缩振动νas(COO- )在1620 cm-1 ，而COD 的νas(COO- )为1646 cm-1 ；COM的νs (COO- ) 位于1315～1316 cm-1 , 而COD的νs(COO- ) 位移至1324～1325 cm-1 。两种物质中的结晶水均在3485～3488 cm-1处有一个宽的吸收峰, 但形状和强度存在区别。对于COM-COD 的混合物, 羰基的νas特征吸收带从1315至1324 cm-1以及νs 从1620 至1 640 cm-1方向位移, 位移的多少取决于混合物中两种化合物的比例[10]。

1.1.2.2 拉曼光谱
拉曼光谱可以鉴定不同类型的结石。含不同结晶水的草酸钙的COO-其拉曼特征峰位置不同，不同磷酸盐的PO43-和HPO42-的拉曼特征峰位置也不同，归因于其振动带的频率与晶体分子结构中的阳离子、邻近的阴离子以及所含的结晶水有关，如表1.2所示。因此，根据拉曼频率的移动很容易区分不同类型的尿结石。例如，鸟粪石的拉曼光谱与磷酸钙相类似，其最强吸收带为PO43-离子的伸缩振动，但根据它们拉曼频率的移动很容易将它们区分。

表1.2 不同结石组分的拉曼频率[9,11]
结晶水数目 拉曼频率/cm-1
CaC2O4•2.86 H2O 1474, 910, 505
CaC2O4•2.20 H2O 1480, 920, 510
CaC2O4•H2O 1632, 1467, 1493, 899
MgNH4PO4•6H2O 950, 566, 436, 295, 228
Ca3(PO4)2 959, 595, 435
CaHPO4•2H2O 990, 881, 590, 530, 387
MgHPO4•3H2O 987, 899, 555, 400, 289, 220
Ca10(PO4,CO3,OH)6(OH)2 1078, 1050, 970, 866

1.1.2.3 核磁共振光谱
药物在体内的代谢产物所诱发的尿石成分非常复杂，采用FT-IR、XRD等方法难以准确地鉴定其成分。Pickens等[12]利用核磁共振光谱和质谱联合分析，得出一例尿石的主要成分为β-(2-甲氧基苯氧基)-丙醇酸的钙盐。β-(2-甲氧基苯氧基)-丙醇酸是愈创木酚甘油醚的在体内的代谢产物，临床上愈创木酚甘油醚用作祛痰药物。

1.1.2.4 高效液相色谱
高效液相色谱法是以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制。Safranow等[13]用高效液相色谱法分析了尿石中所含的六种嘌呤类化合物：尿酸(UA)、2,8-二羟基腺嘌呤(DHA)、黄嘌呤(Xan)、次黄嘌呤(Hyp)、别嘌呤醇(Alp)及羟基嘌呤(Oxp)。

1.1.3 尿石中主要晶体成分草酸钙的存在形成
草酸钙（CaOxa）晶体是泌尿系草酸钙结石无机矿物质的主要组成部分，占70％以上[14]。CaOxa晶体有三种常见晶相：热力学稳定的单斜晶系的一水草酸钙、亚稳态四方晶系的二水草酸钙和热力学不稳定的三水草酸钙(COT)。
COM是CaOxa结石中最常见的形式，它的生成与尿液中草酸根的浓度相关。病理学上认为，患有高草酸尿或肠道炎症的患者摄入富含草酸的食品后易形成高草酸尿，从而诱发COM晶体形成[15]。COM的主晶面( )上钙离子呈密集分布，带有较多正电荷，易在带负电荷的细胞膜表面上发生吸附。
COD在CaOxa结石中也较为常见。柠檬酸盐、酒石酸盐、磷酸盐和表面活性剂等小分子物质、尿大分子都能诱导COD形成，且能减慢COD向COM转变的速率[16-21]。在较低的温度、较高的钙/草酸根摩尔比、较高的pH和较低的相对过饱和度下，均有利于COD优先生长[22]。由于COM和COD晶体的某些晶面及其电荷密度差异，细胞膜上磷脂头基所组成的重复晶格与COM晶体的二维匹配高于COD晶体[23,24]，使得COM晶体与细胞膜表面的吸附能力大约比COD大1.5-2倍，因而初生的COM晶体比COD容易粘附在肾小管表面[24]，COD则容易随尿液排出体外。如果能有效地诱导更多的COD晶体或抑制COD向COM转变，就可以减小草酸钙泌尿结石的形成几率。
热力学不稳定的三斜COT首先是在合成沉淀实验中发现的，后来在对25000个尿结石样品进行X-射线和光学方法研究时发现其为一个结石样品中的一个组成成分。德国乌尔姆的国立泌尿病诊所用红外分析和扫描电镜（SEM）发现，12.7%的结石表面含有COT。有人推测之所以在尿和结石中报道的COT的数目较少的原因是COT在水溶液中会迅速转化。也有人推测在某些肾结石的形成中COT有可能是一种重要的迅速转化的前驱体，就象在骨骼和牙齿的形成中无定形磷酸钙是羟磷灰石的前驱体一样[25]。

1.1.4 尿液微晶与尿结石的关系
尿液中常见的无机沉淀物(结晶)有磷酸铵镁、草酸钙、磷酸钙、尿酸、尿酸铵和尿酸钠。较少见的有碳酸钙、磷酸钙、磷酸镁、胱氨酸、亮氨酸、酪氨酸和马尿酸等。析出的各种无机盐类析出与否，取决于该物质在尿液中的饱和度，而饱和度又受尿液中酸碱度的影响。如尿酸在酸性尿液内最易析出结晶，尿酸钠则在较弱酸性的尿液中便能析出结晶，磷酸铵镁在碱性尿液中便易析出晶体[26,27]。
酸性尿液中的盐类、结晶有尿酸结晶、非结晶性尿酸盐、草酸钙结晶、硫酸钙

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